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種植體表面納米改性方法及其生物學(xué)效應(yīng)研究進(jìn)展
鈦及鈦合金因具有密度小、比強(qiáng)度高、低溫韌性好及抗腐蝕性能優(yōu)異等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于矯形外科及口腔種植等多個(gè)領(lǐng)域。材料的表面形貌特征是影響植入后骨結(jié)合的重要因素。未經(jīng)表面處理的鈦合金的生物惰性限制了其臨床性能和在骨科及口腔科中的應(yīng)用，主要表現(xiàn)在其與骨組織在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上不匹配、缺乏骨誘導(dǎo)性等，從而影響鈦種植體的初期穩(wěn)定性及遠(yuǎn)期成功率。
為獲得理想的種植體表面形貌及提高種植成功率，目前已有多種方法對(duì)其進(jìn)行表面改性，其中納米尺度的表面形貌因其在結(jié)構(gòu)上與細(xì)胞外基質(zhì)相似，能夠很好地模擬細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，增加早期蛋白吸附及后續(xù)細(xì)胞的黏附、增殖與分化而引起廣泛關(guān)注。研究表明，骨組織表面是納米級(jí)與微納米級(jí)結(jié)構(gòu)相結(jié)合的粗糙表面，種植體表面納米改性可形成近似于骨組織的表面形貌，形成促進(jìn)細(xì)胞增殖的微環(huán)境，利于干細(xì)胞的早期黏附及成骨向分化，增強(qiáng)種植體初期穩(wěn)定性。
一方面，通過(guò)種植體表面改性處理形成納米形貌的同時(shí)也改善了材料的理化性能，使其具備高表面能，促進(jìn)早期蛋白層的形成及相關(guān)細(xì)胞增殖分化。另一方面，納米材料因尺寸小、比表面積大，其載藥能力也比普通材料更強(qiáng)，通過(guò)陽(yáng)極氧化形成的納米管狀結(jié)構(gòu)可負(fù)載抗生素、生物肽及多種成骨相關(guān)蛋白等，促進(jìn)早期骨結(jié)合，提高種植體初期穩(wěn)定性。
綜上所述，鈦種植體表面納米改性所形成的粗糙表面可改善骨-種植體界面的應(yīng)力分布及骨結(jié)合，還可負(fù)載其他生物活性分子共同促進(jìn)種植體高效、穩(wěn)定的植入，具有極佳的臨床應(yīng)用前景。因此，文章就鈦種植體表面自納米化改性方法及納米結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響做一綜述，旨在為相關(guān)研究及臨床轉(zhuǎn)化提供思路與線索。
1.純鈦表面納米結(jié)構(gòu)制備方法
種植體材料表面納米改性技術(shù)可分為以下3類。（1）表面涂覆或沉積技術(shù)：在材料表面沉積納米粒子或涂覆納米涂層，此技術(shù)存在結(jié)合強(qiáng)度不夠、涂層易剝脫、遠(yuǎn)期穩(wěn)定性未知等缺點(diǎn)；（2）表面自納米化技術(shù)：依靠機(jī)械錘擊或化學(xué)改性等技術(shù)在材料表面形成納米結(jié)構(gòu)，此技術(shù)依賴材料自身晶體結(jié)構(gòu)的改變，不引入其他成分，具有更高的安全性及臨床應(yīng)用價(jià)值；（3）混合納米化技術(shù)：首先通過(guò)自納米化技術(shù)在材料表面形成納米形貌，使其表面形貌及性能發(fā)生改變，然后與涂層或化學(xué)熱處理等技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，在材料表面負(fù)載其他納米活性分子或形成粒徑不同的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。表面自納米化技術(shù)可改善材料自身的理化性質(zhì)，提高材料的機(jī)械性能，具有較強(qiáng)的臨床應(yīng)用前景，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，以下簡(jiǎn)要介紹其制備方法。
1.1 酸/堿蝕刻處理
酸/堿蝕刻處理是一種化學(xué)表面改性方法。酸蝕處理是指將材料在一定溫度和濕度等條件下浸泡在強(qiáng)酸溶液中，從而有效地在鈦材料表面構(gòu)建直徑為20～100 nm的凹坑結(jié)構(gòu)的方法；堿熱處理是指用強(qiáng)堿溶液浸泡材料后并進(jìn)行高溫處理，形成納米突起狀結(jié)構(gòu)如納米孔、納米針或納米棒等的方法。
研究表明，鈦與氫氧化鈉溶液反應(yīng)后可在鈦表面形成一層非晶態(tài)氧化鈉，該層可以加速磷酸鈣成核，誘導(dǎo)磷灰石沉積。酸堿蝕刻不會(huì)對(duì)材料的機(jī)械性能（如強(qiáng)度及韌性等）產(chǎn)生影響，且可通過(guò)調(diào)節(jié)處理參數(shù)（如溫度、浸泡時(shí)間及酸或堿的濃度等）來(lái)調(diào)節(jié)納米結(jié)構(gòu)的形貌及尺度，進(jìn)而影響相關(guān)細(xì)胞生物活性，且處理技術(shù)簡(jiǎn)便經(jīng)濟(jì)，是當(dāng)前應(yīng)用最多的改性方式。
1.2 陽(yáng)極氧化處理
陽(yáng)極氧化處理是一種有效改善金屬表面形貌的電化學(xué)方法，在酸性電解液的作用下，腐蝕溶解與氧化沉積交替進(jìn)行，最終在材料表面形成具有許多均勻的納米級(jí)管狀表層結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)與正常骨組織膠原纖維的排列相似，在生理pH值下，帶負(fù)電荷的種植體表面可以吸引陽(yáng)離子形成磷酸鈣，促進(jìn)早期骨整合。
陽(yáng)極氧化處理可通過(guò)調(diào)節(jié)電壓、電解液濃度及處理時(shí)間等方法改變納米管的管徑、壁厚及密度等。陽(yáng)極氧化是一種簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的技術(shù)，形成的氧化鈦層具有良好的耐蝕性，且納米管的尺寸、間距或有序/無(wú)序程度均可調(diào)控。研究表明，陽(yáng)極氧化處理所形成的納米管狀結(jié)構(gòu)還可負(fù)載抗生素、生物肽及成骨相關(guān)因子等，提高其表面生物性能。因此該方法具有極佳的臨床應(yīng)用前景。
1.3機(jī)械加工處理
包括磨削、噴砂和超聲噴丸在內(nèi)的技術(shù)已用于制造粗糙/光滑表面以改善機(jī)械特性。機(jī)械加工可導(dǎo)致晶粒變形，產(chǎn)生嚴(yán)重塑性形變，從而在種植體上形成納米級(jí)表面，進(jìn)而提高材料表面拉伸性能、表面硬度和親水性的同時(shí)不會(huì)降低材料韌性。激光改性是一種新型微機(jī)械加工處理技術(shù)，通過(guò)熱效應(yīng)和光子效應(yīng)融化鈦種植體表面，可靈活控制材料表面圖案，是一種高度可控的加工技術(shù)。
3D激光打印金屬制造的多孔鈦結(jié)構(gòu)，可精確地獲得最佳水平的孔隙率，并且可根據(jù)不同的需要通過(guò)調(diào)整支架內(nèi)部的孔隙微觀結(jié)構(gòu)來(lái)改變材料的力學(xué)性能。通過(guò)激光處理在材料表面模仿昆蟲(chóng)翅膀所形成的仿生納米形貌，具有天然的抗菌表面結(jié)構(gòu)，可通過(guò)切割細(xì)菌細(xì)胞膜直接殺死細(xì)菌，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。
2.純鈦表面納米結(jié)構(gòu)分類
2.1 納米管狀結(jié)構(gòu)
納米管狀結(jié)構(gòu)是指材料表面垂直排列的致密管狀結(jié)構(gòu)。其制備方法包括輔助模板法、溶膠-凝膠法、電化學(xué)陽(yáng)極氧化法和水熱法等。在上述制備方法中，電化學(xué)陽(yáng)極氧化法更常用于生物領(lǐng)域。鈦在氟基電解液中的電化學(xué)陽(yáng)極氧化可分為3個(gè)過(guò)程，首先通過(guò)氧化還原反應(yīng)在材料表面形成致密的氧化膜；然后氟離子與氧化層反應(yīng)形成多孔的薄膜狀結(jié)構(gòu)；最后，可溶性絡(luò)合物形成穩(wěn)定多孔的納米管狀結(jié)構(gòu)。
通過(guò)陽(yáng)極氧化形成的納米管具有明確的、非隨機(jī)的物理和化學(xué)性質(zhì)，其直徑及厚度也具有可復(fù)制性。研究表明，材料表面垂直有序排列的納米管狀結(jié)構(gòu)對(duì)植入后組織修復(fù)與再生均有積極影響。成骨細(xì)胞在二氧化鈦納米管表面表現(xiàn)為伸展?fàn)顟B(tài)，可能是由于此處表面電荷密度高，纖維連接蛋白與鈦表面之間的離子吸引緊密，從而導(dǎo)致整合素介導(dǎo)的細(xì)胞黏附。
此外，二氧化鈦納米管還可通過(guò)影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞的行為而對(duì)種植體骨結(jié)合及軟組織整合產(chǎn)生影響。在二氧化鈦納米管上培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和上皮細(xì)胞具有良好的黏附性和增殖能力，且通過(guò)改變納米管的形貌特征（如直徑、厚度等）可對(duì)細(xì)胞活動(dòng)產(chǎn)生不同的影響。
2.2 納米凹陷結(jié)構(gòu)
納米凹陷結(jié)構(gòu)是指材料表面呈凹坑狀的納米級(jí)形貌，主要包括納米溝槽和納米凹坑等。納米凹陷結(jié)構(gòu)可通過(guò)電子束刻蝕、酸堿蝕刻等方法制備。當(dāng)種植體植入后，細(xì)胞與材料接觸時(shí)更易于沿材料溝槽長(zhǎng)軸方向生長(zhǎng)，因此納米溝槽可定向引導(dǎo)細(xì)胞的黏附增殖。這是由于表面溝槽結(jié)構(gòu)可促使黏著斑黏附在材料表面，使偽足得以伸展。
同樣，高度有序的納米孔狀結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出了優(yōu)異的促進(jìn)細(xì)胞增殖和成骨分化的能力，有研究通過(guò)去除陽(yáng)極氧化工藝制備的納米管狀結(jié)構(gòu)層而獲得了高度有序的凹坑狀表面，發(fā)現(xiàn)其具有高度的生物活性，堿性磷酸酶活性試驗(yàn)及茜素紅染色提示其在成骨的各時(shí)期均有正向的促進(jìn)作用。
2.3 納米凸起結(jié)構(gòu)
納米凸起結(jié)構(gòu)是指材料表面呈凸起狀的納米級(jí)形貌，主要包括納米球、納米棒等。納米凸起可通過(guò)水熱法、堿熱法等與陽(yáng)極氧化法等相結(jié)合獲取。不同高度、間距及直徑的納米凸起結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的影響亦存在差異。研究表明，納米凸起結(jié)構(gòu)可使材料表面親水性增強(qiáng)，由納米凸起所形成的高表面積的粗糙表面有利于早期成骨相關(guān)蛋白生成及細(xì)胞附著。與納米管狀結(jié)構(gòu)相似，凸起結(jié)構(gòu)處負(fù)電荷密度高，可吸附更多帶正電荷的蛋白質(zhì)于材料表面，從而影響整合素聚集，進(jìn)一步提高成骨效率。
一般認(rèn)為，在直徑70～300 nm、高度為10～70 nm尺寸范圍的納米凸起能促進(jìn)種植體周圍干細(xì)胞成骨向分化及骨整合。體內(nèi)研究結(jié)果顯示，鈦表面納米棒陣列可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化，當(dāng)納米棒狀結(jié)構(gòu)間距小于96 nm時(shí)可促進(jìn)體外間充質(zhì)干細(xì)胞功能以及體內(nèi)骨整合。此外，除促進(jìn)整合素聚集外，納米凸起還具有類似于天然骨組織的仿生結(jié)構(gòu)，如納米棒可模擬羥基磷灰石晶體、納米球可模擬鈣結(jié)合蛋白等，具有極佳的生物相容性。
2.4 梯度納米結(jié)構(gòu)
梯度納米結(jié)構(gòu)是指材料表面晶粒直徑從納米尺度逐漸增加到宏觀尺度的結(jié)構(gòu)。此結(jié)構(gòu)常通過(guò)表面機(jī)械研磨處理制備，通過(guò)鋼球反復(fù)作用錘擊，使材料表面產(chǎn)生劇烈的塑性變形從而使表層粗晶逐漸細(xì)化至納米級(jí)，產(chǎn)生由表及里的梯度納米結(jié)構(gòu)。
電子顯微鏡下觀察處理后的材料由表及里尺寸呈梯度變化，分別為晶粒尺寸為納米級(jí)的劇烈變形層、中間晶粒明顯變形的亞微米細(xì)晶層和粗晶應(yīng)變層、粗晶基體層。這種由表及里的結(jié)構(gòu)變化使材料本身理化性質(zhì)發(fā)生改變，避免了涂層及表面沉積在實(shí)際應(yīng)用中的剝脫和分離現(xiàn)象，同時(shí)賦予了材料更強(qiáng)的親水性、蛋白質(zhì)吸附力以及生物相容性。
經(jīng)表面處理所形成的梯度納米鈦材料具有高強(qiáng)度、高化學(xué)反應(yīng)活性、高度耐磨性以及抗疲勞性。相對(duì)于毫/微米結(jié)構(gòu)表面，表面機(jī)械研磨處理后的梯度納米結(jié)構(gòu)可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞早期定植和成骨分化，提高成骨效率。體內(nèi)外研究均可表明，梯度納米鈦材料具有較高的生物相容性，可促進(jìn)兔骨缺損模型的骨形成及骨結(jié)合。
3.鈦表面納米改性的生物學(xué)效應(yīng)
理想的鈦種植體需同時(shí)具備促進(jìn)創(chuàng)口愈合、組織再生以及抗菌等多種作用。當(dāng)種植體植入后，微環(huán)境中的多種細(xì)胞如樹(shù)突狀細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等相互影響和調(diào)節(jié)，影響組織修復(fù)和重建。納米級(jí)親水表面可迅速形成蛋白質(zhì)吸附層，進(jìn)而對(duì)相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與行為調(diào)控，控制細(xì)胞對(duì)種植體表面的生物學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)種植體周圍組織再生與重建。
3.1 促血管再生
種植體植入后的創(chuàng)口愈合是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，血管新生在其中尤為重要。新生的血管可攜帶機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中所需的細(xì)胞因子及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)帶來(lái)相關(guān)免疫細(xì)胞及免疫因子參與免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)早期創(chuàng)口愈合及修復(fù)。
鈦表面納米形貌可對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、增殖以及生長(zhǎng)因子的分泌等生物學(xué)行為進(jìn)行調(diào)節(jié)，促進(jìn)創(chuàng)傷后血管重建與再生。此外，種植體周圍血管生成與成骨之間的雙向調(diào)節(jié)作用，對(duì)種植體早期骨結(jié)合具有良好的促進(jìn)作用。研究表明，鈦種植體表面形成的納米級(jí)二氧化鈦纖維狀網(wǎng)絡(luò)可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的成骨及血管生成分化。
3.2 促成骨分化
鈦種植體表面納米結(jié)構(gòu)可促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖及分化，其機(jī)制是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。種植體植入后，成骨細(xì)胞會(huì)通過(guò)絲狀偽足伸展黏附于材料表面，進(jìn)而啟動(dòng)增殖分化，該過(guò)程受材料表面理化性質(zhì)尤其是表面形貌的調(diào)控。
納米級(jí)表面結(jié)構(gòu)粗糙、親水性好以及比表面積大，可促進(jìn)整合素受體蛋白的吸附與表達(dá)，調(diào)控成骨細(xì)胞黏附與聚集。細(xì)胞接觸材料表面時(shí)可產(chǎn)生更大的細(xì)胞骨架張力并直接作用于細(xì)胞核，促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期定植，并以此發(fā)揮其促進(jìn)成骨的效用。
納米改性鈦材料可促進(jìn)表面細(xì)胞黏附及增多細(xì)胞數(shù)量，這種效應(yīng)很可能是由于增加的比表面積、更好的親水性及增加的管外邊緣負(fù)電荷所致。此外，納米級(jí)表面可通過(guò)改變跨膜整合素的排列方式，影響細(xì)胞骨架張力，從而觸發(fā)生物活性細(xì)胞反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)如成骨向分化、基因表達(dá)及組織再生。表面凹坑狀納米結(jié)構(gòu)已被證實(shí)可通過(guò)增強(qiáng)β-連環(huán)蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)人MG63成骨細(xì)胞分化。
3.3 免疫調(diào)控作用
種植體植入后，免疫細(xì)胞與骨組織細(xì)胞相互作用，共同調(diào)控種植體周圍組織組織愈合與重建。單核巨噬細(xì)胞是種植體周圍免疫調(diào)控的關(guān)鍵細(xì)胞，可被激活分化為經(jīng)典的促炎M1型和旁路激活的抗炎M2型巨噬細(xì)胞。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)炎癥因子[如白細(xì)胞介素（interleukin,IL）-12、IL-23、腫瘤壞死因子α及活性氧等]，促進(jìn)病原微生物的吞噬與殺滅。M2型巨噬細(xì)胞分泌大量炎癥抑制因子（如IL-10、清道夫受體及基質(zhì)金屬蛋白酶等）參與組織修復(fù)與重建。
早期研究表明鈦種植體表面形貌可影響巨噬細(xì)胞活性及極化方向。納米結(jié)構(gòu)鈦表面有利于巨噬細(xì)胞絲狀偽足的伸展，促使其向M2型極化，從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞組織修復(fù)相關(guān)因子的基因表達(dá)，具有更強(qiáng)的免疫調(diào)控作用。
3.4 抑菌作用
研究表明，鈦表面納米改性所形成的不同尺寸及形狀的納米結(jié)構(gòu)具有優(yōu)異的抗菌活性。此外，由于其表面粗糙、比表面積大，其載藥能力也優(yōu)于普通材料，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。因二氧化鈦納米管特殊的管狀結(jié)構(gòu)，近年來(lái)學(xué)者們常在小管內(nèi)搭載抗菌藥物來(lái)提高種植體的抗菌性能，其表面負(fù)載抗菌粒子如銀離子、氧化鋅等可對(duì)革蘭陽(yáng)性和陰性菌產(chǎn)生抑制作用。在其表面負(fù)載藥物緩釋系統(tǒng)可精準(zhǔn)調(diào)控藥物釋放劑量、頻率等，以達(dá)到最佳的臨床應(yīng)用效果。
4.結(jié)語(yǔ)
綜上所述，與未經(jīng)改性處理的光滑表面相比，納米結(jié)構(gòu)修飾的鈦種植體表面對(duì)于組織再生、植入后的抗菌作用及免疫調(diào)節(jié)均具有正向促進(jìn)作用。然而，如何確定利于組織修復(fù)的最佳納米表面形貌、尺寸及分布等參數(shù)仍是需攻克的難關(guān)，臨床應(yīng)選擇何種表面形貌的植入材料還有待進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)，同時(shí)相關(guān)分子機(jī)制也有待研究與闡述。
隨著納米科技的發(fā)展，鈦材料表面納米化處理工藝也逐漸趨于成熟，近年來(lái)，種植體表面仿生納米形貌逐漸成為研究熱點(diǎn)，學(xué)者通過(guò)激光打印技術(shù)模仿昆蟲(chóng)翅膀表面天然抗菌形貌，為種植體表面改性處理研究提供了新的思路，隨著研究的擴(kuò)展和深入，必將對(duì)生物醫(yī)用材料的發(fā)展起到極大的推動(dòng)作用。
